Image
Tre dropar av ulik storleik

Dropen til venstre er fraksjonsstorleik, medan den i midten er storleiken på ein heil prøve. Til høgre ein \"normal\" vassdrope, til samanlikning. Storleikane er høvesvis 0,3 mikroliter, 1,5 mikroliter og 50 mikroliter. Foto: Léon Reubsaet

Ekstremt små blodprøvar kan analyserast utan tap av informasjon

Fram til no har det vore vanskeleg å analysera svært små biologiske prøvar utan å mista informasjon i prosessen. Léon Reubsaet drog frå Farmasøytisk institutt til prestisjeuniversitetet Caltech for å løysa problemet.

Mange sjukdommar kan påvisast ved såkalla proteinrelaterte markørar i blodet. Innimellom kan blodprøvane som skal testast vera ekstremt små, av ulike årsaker. Dei kan skriva seg frå celleprøver som er vanskeleg å dyrka fram, prøvane kan vera vanskelege å få tak i, eller dei kan skriva seg frå personar ein ikkje ynskjer å tappa for så mykje blod, som til dømes nyfødde.

– Men metodane som har vore brukt til no, har ført med seg at noko av informasjonen vert borte. Kanskje sit ein att med 80 prosent, kanskje 30 prosent, fortel professor Léon Reubsaet ved Farmasøytisk institutt ved Universitetet i Oslo.

Dela protein i mindre delar

I fjor sommar kom han tilbake til UiO etter halvtanna års opphald ved California Institute of Technology, betre kjent som Caltech. Universitetet ligg i byen Pasadena og er ganske lite med berre 300 vitskapleg tilsette, men har likevel fostra 39 nobelprisvinnarar gjennom å konsentrera seg om nokre få fagområde.

– Utfordringa mi var å laga teknologi for å få maksimal informasjon ut av ekstremt små prøvar. Vi jobba med mengder ned til 300 nanoliter. Ein nanoliter er ein milliontedel av ein milliliter, seier Reubsaet.

Ved hjelp av enzym vert proteina i ein prøve delte opp i mindre delar, som heiter peptidar. Peptidane sine ulike eigenskapar gjer at ein kan skilja dei frå kvarandre i ein prosess som vert kalla fraksjonering.

Ti tusen variantar

– Fraksjoneringa skjer ved at peptidane vert transporterte gjennom ein kolonne, eit slags røyr med eit innhald som gjer at dei ulike peptidane får ulik hastigheit på vegen gjennom. Dermed kan vi finna samansetjinga av proteina i prøven.

– Prosessen køyrer vi to gonger for å skilja på minst to fysiske eller kjemiske eigenskapar eller dimensjonar. Den eine gongen kan det til dømes vera på kor glade peptidane er i feittstoff, den andre gongen kan vi skilja på ladning, forklarar Reubsaet.

– La oss seia at vi finn 100 variablar i kvar av målingane. Då er vi altså oppe i ti tusen variantar.

Apparat med åtte prøveglas i forgrunnen
Fraksjonering. Vi ser den tynne kapillarkolonnen i framgrunnen og dei åtte glasa med fraksjonane. Foto: Léon Reubsaet

Problemet med denne framgangsmåten er at prøven må inn i kolonnen på ein eller anna måte. For dei minste prøvane brukar ein hårtynne kolonner, kapillarkolonner. Men voluma Reubsaet vil finna ei løysing for, er så små at det ikkje let seg gjera å fanga dei opp i kapillarkolonnene ein gong.

– Det er på dette stadiet ein har brukt metodar som har redusert informasjonsverdien av prøvematerialet. Men ved å plassera prøven i ei lita mengde maursyre, fann vi at vi behaldt heile innhaldet i prøven.

Deretter vert prøvematerialet fordelt i åtte prøveglas. Fyrst gjorde Reubsaet dette manuelt, men saman med kollegane frå Caltech konstruerte han eit apparat som gjorde dette automatisk.

– Utan denne automatiseringa av fraksjoneringa ville prosessen verta altfor omfattande for praktisk bruk.

Vert teken i bruk ved UiO

Til slutt går dei åtte fraksjonane ein prosess som heiter massespektrometri, som sorterer langs ein tredje dimensjon.

– Berre databehandlinga av ein slik prøve kan ta eit par dagar. Men sjølve fraksjoneringa får vi unna på eit par timar – og altså utan tap av informasjon. Prøven kan ha innehalde kanskje 10 000 proteinar som har blitt delte opp i 150 000 peptidar, så det er hinsides antal det er snakk om, seier Reubsaet.

Han er svært nøgd med opphaldet ved Caltech, som har ført til ein artikkel om sjølve databehandlinga i tillegg til artikkelen om denne nye analysemetoden. Metoden kjem snart til å bli teken i bruk i forsking òg ved Kjemisk institutt ved UiO.

Seks personar
Léon Reubsaet med medforfattarane frå Caltech. Frå venste:  Spiros D. Garbis, Brett Lomenick, Reubsaet, Annie Moradian, Roxana Eggleston-Rangel og Michael J. Sweredowski. Foto: Privat

Reubsaet m.fl.: Nano volume fractionation strategy for dilute-and-shoot injections in off-line loss-less proteomic workflows for extensive protein identifications of ultra-low sample amounts, Journal of Chromatography A, Jan 2020

Reubsaet m.fl.: Data-Independent Acquisition for the Orbitrap Q Exactive HF: A Tutorial, Journal of Proteome Research, Dec 2018

Les meir på Titan.uio.no: